سيد سعد غباغبي
25-10-2009, 01:10 AM
تقنية PCR
Polymerase Chain Reaction
تفاعل البلمرة المتسلسل
تحفظ المعلومات الوراثية و انتاج المواد لصنع الخلايا و الحفاظ عليها في داخل الحمض النووي (DNA ) . و تقوم الخلية بمضاعفة كمية الحمض النووي وقت انقسام الخلية بشكل تلقائي و بشكل سريع مع وجود نظام تصحيح للأخطاء خلال النسخ. . و تبلغ سرعة النسخ والمضاعفة إلى 1000 قاعدة نيتروجينية بالثانية ( داخل النظام الحيوي ) و هي كما ذكرنا تحدث في الخلية في وقت التكاثر والانقسام فقط .
http://www.werathah.com/learning/images/pcrman.jpgومع التطور في مجال التكنولوجيا الحيوية والذي يقوم على التعامل مع الحمض النووي (DNA ) بشكل أساسي ، استدعى ذلك العلماء على أن يبحثوا عن طريقة أو تقنية تقوم على مضاعفة كمية الحمض النووي (DNA ) بشكل كبير ، فكان هناك عدة محاولات لتنشيط الخلية على الانقسام المستمر بإضافة عوامل النمو growth factors ، ولكن هذه الطريقة لم تكن ذات جده لدى العلماء لأسباب كثيرة. إلى أن توصل العالم د. كري مولس Dr. Kerry Mullis في عام 1985 ( و قد حصل على جائزة نوبل في الكيمياء عام 1993)بنشر اختراعه لتقنية البي سي ار PCR فكانت هذه التقنية بوابة لكثير من التطورات المتسارعة في مجال التكنولوجيا الحيوية ، من أهم الأسباب التي ساعدت هذه التقنية على الانتشار عدم اعتمادها على النظام الحيوي(أي الخلية) و التحكم بكمية الحمض النووي (DNA ) و وسرعة في الإنتاج ولكن كان من عيوب هذه التقنية عدم وجود نظام إصلاح أخطاء الارتباط الخاطئ miss match .
ما هو PCR :
هو تقنية مخبريه تم اكتشافها عام 1983م تقريباً تقوم على إكثار نسخ الحمض النووي (DNA ) خارج النظام الحيوي . أي أنها طريقة لنسخ الحمض النووي في المختبر. و لذلك فهي تقنية حيوية لاستنساخ قطعة من محددة من الحمض النووي و مضاعفة إنتاجها لكي يتسنى إجرى عليه اختبارات و فحوصات إضافية.
ما هي متطلباتPCR :
لتقوم بإنتاج الحمض النووي (DNA ) بواسطة PCR يتتطلب عليك توفير :
1. جهاز للتحكم بدرجات حرارة التفاعل بشمل دقيق و متتالي ( الدورة الحرارية Thermocycle ) : ويقوم هذا الجهاز بتغير درجة الحرارة بشكل سريع ، لآن تغير درجة الحرارة هو الأساس الذي تقوم عليه فكرة هذه التقنية . http://www.werathah.com/learning/images/thermocyler.gif
2. البليمريز : وهو الإنزيم الذي يقوم ببناء وترتيب القواعد النيتروجينية ( حدات الحمض النووي (DNA ) ) ، ويجب أن يكون هذا الإنزيم مقاوم للحرارة العالية ليتمكن من العمل . و قد اكتشف انزيم مقاوم للحرارة و اسم تاج Tag
3. مجموعة متفرقة من القواعد النيتروجينية: ( A T C G ) ليتمكن الإنزيم من ترتيبها في مواقعها أثناء عملية نسخ الحمض النووي (DNA ) .
4. بريمر Primer : وهو قطعة صغيرة من الحمض النووي (DNA ) ليتمكن الإنزيم من بداء البناء و النسخ عليها .
5. والشيء الأهم هو وجود نسخة من الحمض النووي (DNA ) المراد نسخه .
6. بالإضافة إلى محلول أو وسط ليتم به التفاعل : وهذا المحلول يختلف بين تفاعل و أخر .
عملية النسخ : http://www.werathah.com/learning/images/pcr.jpg
بعد وضع الحمض النووي المراد نسخة مع البريمر و و إنزيم البوليمريز و مجموعة مع الأحماض النووية في أنبوب داخل جهاز التحكم الحراري فان هناك 3 مراحل منفصلة تمر بها عملية النسخ:
1. مرحلة التفكيك Denature : رفع الحرارة إلى 94 ْم وذلك لفك الحمض النووي (DNA ) الأصل .
2. مرحلة الالتصاق anneal : إنزال الحرارة إلى ما بين 55-60 ْم ليقوم البريمر بالألتزاق فيزيائياً بواسطة الروابط الهيدروجينية مع الحمض النووي (DNA ) الأصل .
3. مرحلة الامتداد extend : ثم يقوم برفع درجة الحرارة إلى 75 ْم ليقوم البلمريز بعمله في بناء الحمض النووي (DNA ) الجديد .
وهذه المراحل الثلاث تعتبر دورة كاملة وفيها يصبح الحمض النووي (DNA ) الأصل قد تضاعف ، وتعتمد كمية ناتج الحمض النووي (DNA ) على عدد الدورات ( والصورة التالية توضح العملية ) .
لمشاهدة هذه العملية اضغط على هنا (http://www.dnalc.org/mediashowcase/media_item.html?id=1017).
تطبيقات PCR :
لتقنية PCR تطبيقات كثيرة في مجال أبحاث الحمض النووي (DNA ) و الوراثة ومنها :
1. الكشف عن الطفرات الوراثية : وذلك عن طريق وضع بريمر خاص للطفرة لتكثير الجين الخاص بها . ومنه نقوم بمعرفة المرض إذا كان على زوجين الكروموسومات أو على احدهما ( allele ) .
2. تعين البصمة الوراثية .
3. الكشف عن الفيروسات : وهذه الطريق هي الأدق في تحديد نوع وجنس الفيروس وكميته.
4. هو العنصر الأهم في عملية التجميع الجيني ( Recombinant الحمض النووي (DNA ) ) : حيث نقوم بتكثير الجين المراد إدخاله على البلازمد أو الحمض النووي (DNA ) المضيف .
5. استخدامه في تغير نهايات الجين لتصبح متوافقة مع إنزيمات القطع ( Restriction enzyme ) .
6. هو العملية الأساس في تحديد تتابع القواعد النيتروجينية في الحمض النووي (DNA ) ( الحمض النووي (DNA ) Sequencer ) .
7. معرفة طول الحمض النووي (DNA ) .
8. تقنية الحمض النووي (DNA ) المكمل ( cالحمض النووي (DNA ) ) .
9. تحديد الجين المطلوب من خليط من الجينات .
10. يستخدم في تقنية (microarrays ).
11. في مشروع الخارطة الجينية البشرية (human genome project ) .
12. الساوثرين بلوت (southern plot ) .
13. تقنية ارتباط الحمض النووي (DNA ) – بروتين ( الحمض النووي (DNA ) -Protein Interaction ) .
14. في مجال الطب الشرعي ( اختبار الأمومة ، حالات ال****** ، تحديد الهوية ... الخ ) .
وغيرها من التطبيقات المخبرية والبحثية .
أنواع PCR : هناك نوعان من PCR :
1. PCR العادي : وهو ما تم شرحه والتطرق اليه في الخطوات السابقة .
2. rtPCR : وهو اختصار لـ ( Real Time PCR ) : وهذا النوع يقوم على نفس المبدأ ولكن الخلاف الوحيد يكون مربتط الجهاز بكمبيوتر لتحديد الوقت الحقيقي لبدا التفاعل ومن ثم الكمية الحقيقية لعدد نسخ الحمض النووي (DNA ) ويعتمد ذلك على وجود قواعد نيتروجينية حرة مشعة لتحديد ذلك . مما يسهل على الباحثين الوقت لتحدد وجود الجين المطلوب أو لا ، وكمية الجين بدون الوصول إلى نهاية الدورات الحرارية المحددة .
لسماع تسجيل فديو لتسمية البي سي ار بهذا الاسم. اضغط هنا (http://www.dnalc.org/mediashowcase/media_item.html?id=202)
Polymerase Chain Reaction
تفاعل البلمرة المتسلسل
تحفظ المعلومات الوراثية و انتاج المواد لصنع الخلايا و الحفاظ عليها في داخل الحمض النووي (DNA ) . و تقوم الخلية بمضاعفة كمية الحمض النووي وقت انقسام الخلية بشكل تلقائي و بشكل سريع مع وجود نظام تصحيح للأخطاء خلال النسخ. . و تبلغ سرعة النسخ والمضاعفة إلى 1000 قاعدة نيتروجينية بالثانية ( داخل النظام الحيوي ) و هي كما ذكرنا تحدث في الخلية في وقت التكاثر والانقسام فقط .
http://www.werathah.com/learning/images/pcrman.jpgومع التطور في مجال التكنولوجيا الحيوية والذي يقوم على التعامل مع الحمض النووي (DNA ) بشكل أساسي ، استدعى ذلك العلماء على أن يبحثوا عن طريقة أو تقنية تقوم على مضاعفة كمية الحمض النووي (DNA ) بشكل كبير ، فكان هناك عدة محاولات لتنشيط الخلية على الانقسام المستمر بإضافة عوامل النمو growth factors ، ولكن هذه الطريقة لم تكن ذات جده لدى العلماء لأسباب كثيرة. إلى أن توصل العالم د. كري مولس Dr. Kerry Mullis في عام 1985 ( و قد حصل على جائزة نوبل في الكيمياء عام 1993)بنشر اختراعه لتقنية البي سي ار PCR فكانت هذه التقنية بوابة لكثير من التطورات المتسارعة في مجال التكنولوجيا الحيوية ، من أهم الأسباب التي ساعدت هذه التقنية على الانتشار عدم اعتمادها على النظام الحيوي(أي الخلية) و التحكم بكمية الحمض النووي (DNA ) و وسرعة في الإنتاج ولكن كان من عيوب هذه التقنية عدم وجود نظام إصلاح أخطاء الارتباط الخاطئ miss match .
ما هو PCR :
هو تقنية مخبريه تم اكتشافها عام 1983م تقريباً تقوم على إكثار نسخ الحمض النووي (DNA ) خارج النظام الحيوي . أي أنها طريقة لنسخ الحمض النووي في المختبر. و لذلك فهي تقنية حيوية لاستنساخ قطعة من محددة من الحمض النووي و مضاعفة إنتاجها لكي يتسنى إجرى عليه اختبارات و فحوصات إضافية.
ما هي متطلباتPCR :
لتقوم بإنتاج الحمض النووي (DNA ) بواسطة PCR يتتطلب عليك توفير :
1. جهاز للتحكم بدرجات حرارة التفاعل بشمل دقيق و متتالي ( الدورة الحرارية Thermocycle ) : ويقوم هذا الجهاز بتغير درجة الحرارة بشكل سريع ، لآن تغير درجة الحرارة هو الأساس الذي تقوم عليه فكرة هذه التقنية . http://www.werathah.com/learning/images/thermocyler.gif
2. البليمريز : وهو الإنزيم الذي يقوم ببناء وترتيب القواعد النيتروجينية ( حدات الحمض النووي (DNA ) ) ، ويجب أن يكون هذا الإنزيم مقاوم للحرارة العالية ليتمكن من العمل . و قد اكتشف انزيم مقاوم للحرارة و اسم تاج Tag
3. مجموعة متفرقة من القواعد النيتروجينية: ( A T C G ) ليتمكن الإنزيم من ترتيبها في مواقعها أثناء عملية نسخ الحمض النووي (DNA ) .
4. بريمر Primer : وهو قطعة صغيرة من الحمض النووي (DNA ) ليتمكن الإنزيم من بداء البناء و النسخ عليها .
5. والشيء الأهم هو وجود نسخة من الحمض النووي (DNA ) المراد نسخه .
6. بالإضافة إلى محلول أو وسط ليتم به التفاعل : وهذا المحلول يختلف بين تفاعل و أخر .
عملية النسخ : http://www.werathah.com/learning/images/pcr.jpg
بعد وضع الحمض النووي المراد نسخة مع البريمر و و إنزيم البوليمريز و مجموعة مع الأحماض النووية في أنبوب داخل جهاز التحكم الحراري فان هناك 3 مراحل منفصلة تمر بها عملية النسخ:
1. مرحلة التفكيك Denature : رفع الحرارة إلى 94 ْم وذلك لفك الحمض النووي (DNA ) الأصل .
2. مرحلة الالتصاق anneal : إنزال الحرارة إلى ما بين 55-60 ْم ليقوم البريمر بالألتزاق فيزيائياً بواسطة الروابط الهيدروجينية مع الحمض النووي (DNA ) الأصل .
3. مرحلة الامتداد extend : ثم يقوم برفع درجة الحرارة إلى 75 ْم ليقوم البلمريز بعمله في بناء الحمض النووي (DNA ) الجديد .
وهذه المراحل الثلاث تعتبر دورة كاملة وفيها يصبح الحمض النووي (DNA ) الأصل قد تضاعف ، وتعتمد كمية ناتج الحمض النووي (DNA ) على عدد الدورات ( والصورة التالية توضح العملية ) .
لمشاهدة هذه العملية اضغط على هنا (http://www.dnalc.org/mediashowcase/media_item.html?id=1017).
تطبيقات PCR :
لتقنية PCR تطبيقات كثيرة في مجال أبحاث الحمض النووي (DNA ) و الوراثة ومنها :
1. الكشف عن الطفرات الوراثية : وذلك عن طريق وضع بريمر خاص للطفرة لتكثير الجين الخاص بها . ومنه نقوم بمعرفة المرض إذا كان على زوجين الكروموسومات أو على احدهما ( allele ) .
2. تعين البصمة الوراثية .
3. الكشف عن الفيروسات : وهذه الطريق هي الأدق في تحديد نوع وجنس الفيروس وكميته.
4. هو العنصر الأهم في عملية التجميع الجيني ( Recombinant الحمض النووي (DNA ) ) : حيث نقوم بتكثير الجين المراد إدخاله على البلازمد أو الحمض النووي (DNA ) المضيف .
5. استخدامه في تغير نهايات الجين لتصبح متوافقة مع إنزيمات القطع ( Restriction enzyme ) .
6. هو العملية الأساس في تحديد تتابع القواعد النيتروجينية في الحمض النووي (DNA ) ( الحمض النووي (DNA ) Sequencer ) .
7. معرفة طول الحمض النووي (DNA ) .
8. تقنية الحمض النووي (DNA ) المكمل ( cالحمض النووي (DNA ) ) .
9. تحديد الجين المطلوب من خليط من الجينات .
10. يستخدم في تقنية (microarrays ).
11. في مشروع الخارطة الجينية البشرية (human genome project ) .
12. الساوثرين بلوت (southern plot ) .
13. تقنية ارتباط الحمض النووي (DNA ) – بروتين ( الحمض النووي (DNA ) -Protein Interaction ) .
14. في مجال الطب الشرعي ( اختبار الأمومة ، حالات ال****** ، تحديد الهوية ... الخ ) .
وغيرها من التطبيقات المخبرية والبحثية .
أنواع PCR : هناك نوعان من PCR :
1. PCR العادي : وهو ما تم شرحه والتطرق اليه في الخطوات السابقة .
2. rtPCR : وهو اختصار لـ ( Real Time PCR ) : وهذا النوع يقوم على نفس المبدأ ولكن الخلاف الوحيد يكون مربتط الجهاز بكمبيوتر لتحديد الوقت الحقيقي لبدا التفاعل ومن ثم الكمية الحقيقية لعدد نسخ الحمض النووي (DNA ) ويعتمد ذلك على وجود قواعد نيتروجينية حرة مشعة لتحديد ذلك . مما يسهل على الباحثين الوقت لتحدد وجود الجين المطلوب أو لا ، وكمية الجين بدون الوصول إلى نهاية الدورات الحرارية المحددة .
لسماع تسجيل فديو لتسمية البي سي ار بهذا الاسم. اضغط هنا (http://www.dnalc.org/mediashowcase/media_item.html?id=202)